橄榄蛏蚌不同组织苹果酸脱氢酶的研究

王朝知道·作者佚名 2009-08-12

分类: 理工学科

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参考答案:

在高等植物中，光合碳同化主要有3种类型：C3途径，C4途径和景天酸代谢途径(CAM)。C3植物中，CO2的固定主要取决于1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的活化状态，因为该酶是光合碳循环的入口钥匙。它催化1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)羧化，将大气中的CO2同化，产生两分子磷酸甘油酸，可见RuBPCase在C3植物中同化CO2的重要性。C4植物是从C3植物进化而来的一种高光效种类。与C3植物相比，它具有在高光强，高温及低CO2浓度下，保持高光效的能力。C4植物固定CO2的酶为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)，与C3作物中RuBPCase相比，PEPCase对CO2的亲和力高。C4植物的细胞分化为叶肉细胞和鞘细胞，而光合酶在两类细胞中的分布不同，如PEPCase在叶肉细胞固定CO2，生成草酰乙酸(OAA)，OAA进一步转化为苹果酸(Mal)，Mal进入鞘细胞，脱羧，被位于鞘细胞内的RuBPCase羧化，重新进入卡尔文循环。这种CO2的浓缩机理导致了鞘细胞内的高浓度的CO2，一方面提高RuBPCase的羧化能力，另一方面又大大抑制了RuBPCase的加氧活性，降低了光呼吸，从而使C4植物保持高的光合效率。正是因为C4途径具有高光合能力，自60年代以来，试图利用C4光合特性来改进C3植物的光合效率，一直是一个引人注目的研究问题。多年来，人们希望通过C3植物与C4植物杂交，将C4植物同化CO2的高效特性转移到C3植物中去，但至今尚未取得令人满意的结果，其杂种F1和F2代的光合效率均比任何一个亲本都低，基于上述情况，试图通过杂交将具有C3途径的许多作物(如水稻、小麦，大豆)改造为具有C4途径植株的可能性极微。但却可能从C3植物中筛选出有PEPCase及C4途径表达较高的变异株，并加以遗传改进，从而提高C3植物的光合效率。所以几十年来，人们设想在那些利用杂种优势不明显的品种内，如C3作物大豆、小麦中筛选高光效品种。Winter(1974)指出C3植物(如小麦、大麦)不同的绿色器官中，PEPCase，RUBPase的活性存在显著差异。这不仅表现在碳同化速率上，同时也表现在碳素同化的途径上。随着人们发现C3植物中存在C4途径，根据这一特点，寻找C4途径表达强的C3植物逐渐成为光合研究的一个侧重点。为此，大量的工作已经被开展并已取得许多令人欣喜的成果。不仅证明了在C3植物中C4途径的存在，而且发现同种植物中不同品系间C4途径的强弱有较大差异。但是有关C4途径在C3植物中的表达方式及途径的研究开展还很少，人们仅发现C3植物中C4途径的客观存在，至于C4途径在C3植物中的作用机理及在植物光合作用中所占的比例，均有争议，但无论如何，有关C3植物中C4途径存在的发现及由此进行的筛选高光效品系工作，为基因工程改造培育新品种和高产农作物提供了理论依据。

1 C3植物中C4途径的发现及研究现状

C3植物中C4途径的发现是伴随着C4途径的发现而发现的。1953年Calvin确定了植物体内C3途径的存在，1965年Kortschack等在夏威夷甘蔗试验中观察到CO2固定的初期产物是四碳酸，1966年，澳大利亚的Hatch在甘蔗研究上获得了证实，并提出了C4途径。从此植物界光合碳同化方式有了C3途径和C4途径的区分。但是随着研究的日益深入，科学家们发现C3植物和C4植物的区分并非绝对的。Duffus等(1973)报道在C3植物大麦颖片中，具有高于叶片中的PEPCase含量，而PEPCase是C4途径中关键性酶，因此提出了C3植物中可能有C4途径的存在。Nutbeam等(1976)发现，非成熟的C3作物大麦种子固定CO21 min后，84%的14C分布在苹果酸中，其余的在戊糖磷酸和蔗糖中。固定后2 min，主要标记产物是蔗糖，6分钟后，蔗糖中的14C占整个固定14CO2的94%。从而进一步证实了C3植物中C4途径的存在。在粟米草属(Mollugo nudicaulis)中同一植物内可同时存在光合作用的C3和C4途径，嫩叶属C3途径，老叶属C4途径，中部叶属于中间类型。在其它C3植物中，亦发现有C4途径的存在，如宽叶香蒲(Typha latifolia)和芫荽(Coriandrum sativum)(刘振业等，1983)。Cheng等(1988)，Moore等(1989)和Ku等(1991)曾报道，在黄花菊属(Flaveria)中有类似C4途径的种类，它们表现出C4植物的特征；另外Bowes等(1989)指出在水韭属(Isoeres)种类中也具有同样的现象。Reiskind等(1997)发现一种两栖植物黑藻(Hydrilla verticillata)，在冬季C3代谢很旺盛，而在夏季水生条件下，尽管不具有“Kranz”结构，但仍有活跃的C4代谢。看来，高等植物CO2的两种类型代谢途径，C3和C4途径不是截然分开的，而是相互联系的，在一定条件下可以相互转化的。

Hatch等(1990)经过数年的观察，他们认为判定植物体内是否具有C4途径，必须符合以下两个条件：①酶学研究，即C4途径有关的酶PEPCase，NAD(P)-苹果酸酶，NAD(P)-苹果酸脱氢酶，丙酮酸磷酸双激酶及碳酸酐酶等，与C3植物体内相应的同功酶比较，活性较高。②14CO2示踪试验证明：CO2的最初产物为C4酸即苹果酸(Mal)和天冬氨酸(Asp)，而且这些有机酸脱羧后，CO2转移到有机物如糖类、淀粉中去。

1.1 酶学研究

近几十年来，人们围绕着C3植物中C4酶的存在做了大量工作，并取得了许多成果。PEPCase是C4途径的最初固定CO2的酶，大量研究表明，PEPCase不仅存在于C4植物中，而且也广泛存在于C3植物中。Ting等(1973)认为C3植物PEPCase对底物PEP，HCO3的亲和力也比C4植物中同功酶的亲和力约高6倍。因此PEPCase在C3植物中碳代谢作用是不可忽视的，尤其当植物体内外条件发生变化时，其活性发生显著变化。如烟草感染花叶病毒时，RUBPase被抑制，其功能可部分地被PEPCase代偿；小麦和大豆在干旱条件下，PEPCase活性可被显著提高。近来，Jenkins(1989)用PEPCase专一性抑制剂3，3-2氯-2-(二羟膦甲基)-丙烯酯(DCDP)证明，C3植物中C4光合酶PEPCase对CO2的同化有一定的贡献。郝乃斌等(1991b)的研究表明，大豆不同器官中的PEPCase/RuBPCase的比值差异显著，其中叶片中的比值最低，为0.27，而种皮中的比值最高为8.66，子叶中为6.49，这说明大豆种皮和子叶中PEPCase活性要比该器官中的RuBPCase活性高出几倍。而且还证明，PEPCase不仅大量固定呼吸作用所释放的CO2，同时还可以通过C4途径固定CO2。C4途径的存在标志着细胞有可能通过“CO2泵”的方式提高光合碳循环的CO2浓度，使RuBPCase的催化方向朝着有利于形成碳水化合物的方向运转。Kelly(1977)等认为与C4植物中的PEPCase相比，C3植物体内的活性较低，但与碳同化中的一些限速酶的活性相比，C3植物中的PEPCase的活性仍然是可观的。

碳酸酐酶(CA)在C4光合中是种很关键的酶，它催化CO2到HCO3的快速转化，而HCO3是PEPCase的底物。Hatch等(1990)利用生化和分子生物学技术研究发现，CA有两种，即细胞质CA和叶绿体CA，C4植物体内的CA主要是细胞质CA，而C3植物的CA主要是叶绿体CA，这2种CA动力学性质及对CO2的亲和力和对抑制剂的敏感性相似。Popova等(1990)发现CA位于C3植物的叶绿体中，它的浓度变化因植物种类而异，一般在86%～96%的范围，在C3植物中，CA同样有效地将CO2转化为HCO-3，为PEPCase提供底物，从而为C3植物中的C4途径顺利进行打下基础。

丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)是C4途径的专一性酶，Duffus等(1973)在大麦颖果的青色种皮中，Kisaki等(1973)在烟草的幼苗及Meyer(1982)在未熟的小麦颖果中相继发现PPDK的存在。Aoyagi等(1986)年也证实在C3植物中，存在着与C4植物同样的丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)。Hata等(1987)及Aoyagi等(1984)证明，PPDK不但位于叶绿体中，而且还存在于小麦种子的细胞质中；Imaizumi(1991)通过Northern blot分析发现，在水稻种子的细胞质中有PPDK存在。Rosche等(1994)认为PPDK是C4光合作用的关键酶，它催化固定CO2的最初受体PEP的再生。PPDK大部分位于叶肉细胞，它的活性已在C3植物的光合组织中被测定。Imaizumi等(1997b)发现水稻开花6天后，外稃中的苹果酸中14C分布比开花初期高，而外稃中的PPDK在开花6 d的含量也相应地高于开花初期，这些结果显示，PPDK的功能与外稃中的C4代谢有关。已报道C3植物中的PPDK与C4植物中的PPDK具有相同的酶学特征，如被光激活(Aoyogi等，1984)，对冷胁迫的敏感(Aoyogi等，1984)，催化性质(Meyer等，1982)等。Hata等(1987)发现C3植物水稻幼苗体内的PPDK与C4植物玉米的PPDK无论在蛋白分子量，抗原决定簇和蛋白质结构等方面都相同。

Edwards等(1983)认为NAD(P)-苹果酸酶是催化L-苹果酸脱羧的酶，在C3，C4及CAM植物中广泛存在。Scheibe(1990)发现NADP-苹果酸脱氢酶是催化草酰乙酸转化为Mal的酶，在自然界中广泛存在，因此认为C3植物的NADP-MDH在碳代谢中与C4型植物的NADP-MDH同样重要。

在大豆的豆荚，西红柿的果皮，小麦及水稻的颖果中存在着一种C3-C4中间型或类似C4的光合途径(Edwards等，1983)。有关C4途径的光合酶，如PEPCase，PPDK，NAD(P)-ME及NAD(P)-MDH在这些器官中具有较高的活力。在大麦和小麦的穗中，在大豆的豆荚中有较高的PEPCase和RuBPCase活性，在西红柿的果皮中也具有相同的现象。Imaizumi等(1991，1997a)指出在水稻的园锥花序的外稃和内稃中，有关C4途径的酶(PEPCase，PPDK，NAD(P)-ME及NAD(P)-MDH)的活性分别是在RuBPCase活性的67%～171%之间浮动。因为植物体内的物质代谢是多重的，例如Latzko等(1983)认为C3植物体内的PEPCase的作用不仅行使C4途径，固定外界CO2，生成苹果酸，而且生成的Mal还可以用来维持细胞的pH，也还可以作为三羧酸循环(TCA)的中间产物来参与呼吸代谢。

1.2 CO2同化后的最初产物及转换

Hatch等(1961)提出，在C4途径中固定外界CO2的最初产物为苹果酸(Mal)和天冬氨酸(Asp)，为此许多人用14CO2示踪技术，来证明C3植物中不仅存在高活性的C4途径光合酶，同时从CO2同化产物方面来证实C4途径的存在。

Nutbeam等(1976)证明，在C3作物大麦中不仅具有高活性的PEPCase，而且利用14CO2示踪还证明14C的最初固定产物为四碳酸—Mal，而不是3-磷酸甘油酸